植物細胞懸浮培養(yǎng)用培養(yǎng)搖床的實驗方法
1.用鑷子夾取出生長旺盛的松軟愈傷組織,放入三角瓶中并輕輕夾碎.每100ml三角瓶含滅過菌MS培養(yǎng)基10~15ml,每瓶接種1~1.5g愈傷組織,以保證zui初培養(yǎng)物中有足夠量的細胞.
2.將已接種的三角置于旋轉(zhuǎn)式搖床上.在100r/min,25~28℃條件下,進行振蕩培養(yǎng).
3.經(jīng)6~10天培養(yǎng)后,若細胞明顯增殖,可向培養(yǎng)瓶中加新鮮培養(yǎng)基10ml,必要時,可用大口移液管將培養(yǎng)物分裝成兩瓶,繼續(xù)培養(yǎng).（若細胞無明顯增殖,可能是起始材料不適當,應(yīng)考慮用旺盛增殖期的愈傷組織重新接種）.可進行*次繼代培養(yǎng).
4.縣浮培養(yǎng)物的過濾：按“3”法繼代培養(yǎng)幾代后,培養(yǎng)液中應(yīng)主要由單細胞和小細胞團（不多于20個細胞）組成.若仍含有效大的細胞團,可用適當孔徑的金屬網(wǎng)篩過濾,再將過濾后的縣浮細胞繼續(xù)培養(yǎng).
5.細胞計算.取一定體積的細胞縣液,加入2倍體積的8%的三氧化鉻（CrO3）,置700C水浴處理15min.冷卻后,用移液管重復(fù)吹打細胞懸液,以使細胞充分分散,混勻后,取一滴縣液置入血細胞計數(shù)板上計數(shù).
6.制作細胞生長曲線：為了解縣浮培養(yǎng)細胞的生長動態(tài),可用以下方法繪制生長曲線圖：
（1）鮮重法（fresh weigh method）
在轉(zhuǎn)代培養(yǎng)的不同時間,取一定體積的懸浮細胞培養(yǎng)物,離心收集后,稱量細胞的鮮重,以鮮重為縱座標,培養(yǎng)時間為橫座標,繪制鮮重增長曲線.
（2）干重法（dry weigh method ）
可在稱量鮮重之后,將細胞進行曲烘干,再稱量干重.以干重為縱坐標,培養(yǎng)時間為橫坐標,繪制細胞干重生長曲線.
上述兩種方法均需每隔2天取樣一次,共取7次,每個樣品重復(fù)三次,整個實驗進行期間不再往培養(yǎng)瓶中換入新鮮培養(yǎng)液.
7.細胞活力的檢查.對于初學(xué)者,往往需要檢測活細胞的比率.可在培養(yǎng)的不同階段,吸取一滴細胞縣液,放在載玻片上,滴一滴0.1%的酚藏花紅溶液（用培養(yǎng)基配制）染色,在顯微鏡下觀察.幾活細胞均不著色,而死細胞則很快被染成紅色.也可用0.1%熒光雙醋酸酯溶液染色,凡活細胞將在紫外光誘發(fā)下顯示藍絕色熒光,有經(jīng)驗的操作者,則可根據(jù)細胞形態(tài),胞質(zhì)環(huán)流判別細胞的死活.
8.細胞再生能力的鑒定：為了解懸浮培養(yǎng)細胞是否仍具有再生能力,可將培養(yǎng)細胞轉(zhuǎn)移到瓊脂固化的培養(yǎng)基上,使基再形成愈傷組織,進而在分化培養(yǎng)基上,誘導(dǎo)植株的分化.